實(shí)時
熒光-PCR法是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的技術(shù)。它通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析就此掀開。實(shí)時熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)核心技術。
對熒光-PCR法的數(shù)據(jù)處理我們要了解一個關(guān)鍵的因素“Ct值”知識和技能。在實(shí)時定量PCR的數(shù)據(jù)圖中開放要求,x-軸表示PCR循環(huán)數(shù),y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值,也就是擴(kuò)增產(chǎn)物的量規模。這個圖中有基線逐步顯現、閾值、Ct值這幾個概念,從這幾個值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量近年來。
基線是擴(kuò)增曲線中的水平部分。在反應(yīng)初階段事關全面,雖然產(chǎn)物是指數(shù)級增長交流等,但是由于總量太少,其熒光處于背景水平發展目標奮鬥,檢測不到熒光增加自動化裝置。因此基線信號的產(chǎn)生是由于測量的偶然誤差引起的。然而當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物不斷完善,足以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時,這個信號的值就被稱為閾值全面革新,通常閾值默認(rèn)為基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10勞動精神。在閾值的前后,PCR的反應(yīng)仍然是指數(shù)級增長的方便,因此此時的PCR結(jié)果可靠明顯,可以準(zhǔn)確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號強(qiáng)度達(dá)到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)基石之一,也就是擴(kuò)增曲線與閾值的交叉點(diǎn)基礎上。
為什么知道了Ct值就能夠得到初的目的基因含量呢?
一個基因的單次反應(yīng)擴(kuò)增曲線中要計算擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)N行業分類,它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方預下達,n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說資料,如果擴(kuò)增效率為100%自動化,產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然集成,在線性增長期和平臺期規模最大,擴(kuò)增效率不可能是100%,因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立。