RT-PCR試劑盒合適的溫度通常在45-68℃之間(預(yù)備實(shí)驗(yàn)可2℃間隔進(jìn)行)前景。另外,由于在60-68℃間全技術方案,也有很高的活性深度,因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定溫度,進(jìn)行2 Step PCR狀況。
RT-PCR試劑盒是為兩步法RT-PCR一步實(shí)驗(yàn)配制的範圍和領域,具有高靈敏度的RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng),可以從極低量的總RNA或poly(A)+RNA合成一鏈cDNA業務。與PCR反應(yīng)相結(jié)合,可用于檢測(cè)稀有基因的表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測(cè)特定mRNA的表達(dá)水平完善好、克隆特定基因的cDNA片段等促進進步。合理配備與cDNA一鏈合成反應(yīng)相關(guān)的各種組分,該試劑盒有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性全過程,對(duì)后續(xù)的PCR或定量PCR實(shí)驗(yàn)兼容性好發揮效力,適合于各種PCR耐熱聚合酶。
RT-PCR試劑盒試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行的PCR反應(yīng):
1.吸取10%的一鏈反應(yīng)液(2μl)進(jìn)行PCR反應(yīng)勞動精神;即使加入更多量的一鏈反應(yīng)液也不能增加其擴(kuò)增的產(chǎn)物量結構,反而可能會(huì)抑制正常的PCR反應(yīng);
2.94℃加熱變性2min落到實處;
3.設(shè)置15-40個(gè)PCR循環(huán)效果。退火與延伸條件依引物和模板而定。
相關(guān)注意事項(xiàng):
1.用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡量可能用DEPC進(jìn)行處理營造一處,并在高壓滅菌后使用服務水平。有些試劑不能高壓滅菌時(shí),首先用經(jīng)過滅菌的器具保供、水等配制溶液后能力建設,再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。
2.RNA樣品要避免基因組DNA污染技術創新。
3.避免多次反復(fù)凍融RNA醒悟,使RNA保持在冰浴中處融化狀態(tài)。
4.試劑盒的各組成成分應(yīng)在-20℃保存生產體系。
5.cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存新模式。