熒光-PCR法反應體系中的引物和dNTP濃度：

　　1.定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的研究進展。因脫鹽而除去的苯甲酰基和異丁?；苌贉贤C製，因此不會干擾PCR。部分應用需要純化體系，以除去在合成過程中的任何非全長序列宣講活動。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環(huán)過程服務延伸，在每個堿基加入時使用重復化學反應新技術，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗共創美好。較長的引物，尤其是大于50個堿基高效流通，截斷序列的比例很大預判，可能需要純化。

　　2.引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件有力扭轉。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃調解製度。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物形式，使其最終濃度為100μM覆蓋範圍。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸功能，會引起寡核苷的水解前沿技術。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周積極性。干粉引物可以在-20℃保存至少1年深入交流，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。

　　3.引物的濃度會影響特異性性能。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM動力。較高的引物濃度會導致非特異性產(chǎn)物擴增。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導或產(chǎn)生引物二聚體,過低則降低產(chǎn)量方案。利用紫外分光光度計,可精確計算引物濃度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算：

　　X mol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)多種方式。

　　X：引物摩爾濃度,A、C實施體系、G臺上與臺下、T：引物中4種不同堿基個數(shù)。

　　4.不要使用寡聚核苷酸作為標準新創新即將到來，在EB染色的膠上估算引物濃度生產效率，因為引物和標準的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大創新的技術。

　　5.dNTP溶液呈酸性，普通廠家的dNTP溶液一般均未調(diào)pH更合理，應用1mol/l NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將dNTP貯存液pH調(diào)至7.0有序推進，以保證反應的pH值不低于7.1。再用紫外分光光度計定量。配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存表示。多次凍融會使dNTP降解。

　　6.決定低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成緊迫性，理論上在100μl反應體系中質生產力，4×dNTPs濃度若用20μmol/L，基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA非常激烈。

　　7.在PCR反應中提升行動，dNTP應為50-200umol/L，當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性技術交流。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入交流。

　　8.dNTP含有磷酸根，能與Mg2+結(jié)合關註，使游離的Mg2+濃度降低溝通協調。其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L提供堅實支撐，低于1.5mmol/L的Mg2+濃度活動。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時創造更多，必須相應調(diào)整Mg2+的濃度還不大。