PCR擴增試劑盒應用前要計算好各試劑的使用量認為，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻國際要求，10000rpm離心10s各領域，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL技術特點，10000rpm瞬時離心10秒。
引物是PCR特異性反應的關鍵共同努力，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度保持競爭優勢。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列發展邏輯，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物方案，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物遵循的原則如下：
1.引物長度：15-30bp發展機遇，常用為20bp左右創新延展。
2.引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜長效機製，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶聽得進。ATGC隨機分布深入，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)全技術方案，避免兩條引物間互補基本情況，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體重要的，產(chǎn)生非特異的擴增條帶充分發揮。
5.引物3'端的堿基共享，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對全面展示，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗姿勢。
6.引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列有適宜的酶切位點講實踐，這對酶切分析或分子很有好處增幅最大。
7.引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
8.引物量：每條引物的濃度0.1-1umol或10-100pmol最為顯著，以引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好滿意度，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會生產能力。
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更新時間：2022-08-25
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